在进行大肠杆菌培养时，首先取50毫升的过夜菌液放入离心管中，进行5000g离心1分钟，以收集细菌沉淀，然后弃去上清。该过程重复一次，每管共收集100毫升的细菌沉淀。通常，建议将大肠杆菌培养于LB培养基中过夜（约16小时），至光密度（OD值）达到2-4。离心时，保持在5000g（通常约为5000rpm），如沉淀不充分，可适当延长离心时间，但注意，过长时间或过快的离心速度可能会导致沉淀过于紧密，不易于后续加入的溶液I进行溶解。

直接弃掉上清后，加入约50毫升的菌液，并重复上述操作，随后将管子倒置于吸水纸（可以使用普通草纸）上，使液体完全流尽。如果细菌密度偏低，可以考虑增加菌液的体积，并重复此过程1-2次。对于高拷贝质粒，每管的菌液量一般不超过150毫升；对低拷贝质粒，每管的菌液量一般不超过200毫升，因为细菌过量会导致后续裂解步骤不充分。

然后每管加入5毫升溶液I，进行重悬细菌沉淀，确保沉淀完全分散，没有明显的细菌团块。在加入溶液I时，应确认RNaseA已经加入。使用vortex最高速度搅拌10-20秒，以充分悬浮沉淀。观察光亮处的悬浊液应均匀无团块。如果没有vortex，可以用枪吸吹来逐渐散开沉淀，或用手指轻轻弹开。

接下来为每管加入5毫升溶液II，轻轻颠倒离心管4-6次，并在室温下静置1-2分钟，以确保细菌完全裂解，溶液变为透明。切忌vortex！因为剧烈搅拌可能会导致基因组DNA断裂，并造成最终质粒被污染。如果加入溶液I后沉淀未完全分散，可能在颠倒4-6次后依然存在团块，则可增加颠倒次数再静置2-3分钟，但总裂解时间不得超过5分钟。

然后每管加入7毫升溶液III，并随即颠倒离心管4-6次以混匀，此时可以看到白色絮状物的产生。再一次，切忌vortex，颠倒次数也不宜过多，以避免影响质粒的最终质量。接着，进行12,000-14,000rpm的室温离心10分钟。如果离心机速度较低，可酌情延长离心时间，例如在5000-6000rpm时需要离心20-30分钟，直至沉淀充分。

离心完成后，将上清液倒入质粒纯化柱内，进行12,000-14,000rpm离心2分钟，然后弃掉收集管内的液体。此时，质粒可直接倒入纯化柱进行离心，无需等待。务必保留收集管以便后续使用。如果离心后仍有少许漂浮物，可考虑再次离心，或者使用自制漏斗过滤去除。

在质粒纯化柱中加入12毫升溶液IV，进行12,000-14,000rpm离心2分钟，以清洗杂质，再次弃掉收集管内的液体。继续进行12,000-14,000rpm的离心2分钟，以去除残留液体并确保微量的乙醇完全挥发。微量的乙醇会对最终质粒的质量产生影响。

接下来，将质粒纯化柱置于50毫升离心管上，加入2毫升溶液V，保持2分钟。可用重蒸水或Milli-Q级纯水代替溶液V，但水的pH值应不低于6.5。此时，溶液V如果留置的时间稍长，可略有助于提高质粒产量。若想获得更高浓度的质粒，可加入1毫升溶液V进行洗脱，质粒得率会减少约5-10%，具体取决于样品。

进行12,000-14,000rpm离心2分钟后，所得液体即为高纯度的质粒，通常浓度为0.1-0.3 mg/ml，适合用于细胞转染。如果需要获得高浓度质粒，则可采用异丙醇沉淀法浓缩质粒，或常规的乙醇沉淀法。

在异丙醇沉淀步骤中，加入相当于样品体积0.7倍的常温异丙醇（例如1毫升样品中加入0.7毫升异丙醇），激烈混匀后，在4℃下进行12000-14000rpm离心10分钟，小心吸去上清液，注意不要触及沉淀。若期望高浓度质粒，推荐使用1毫升洗脱液进行洗脱，之后可转移至2毫升离心管内继续异丙醇沉淀。

在17上、60度酒精洗涤质粒沉淀后，轻轻悬起以清洗，12,000-14,000rpm在4℃下离心5-10分钟，冷静小心吸去上清液。最后，观察到没有明显液体后，加入适量的溶液（如溶液V、10mM Tris-Cl pH 8.5或Milli-Q级纯水）来溶解DNA。切记，DNA样品不应过于干燥，以免难以溶解。在溶解过程中，建议在弱碱性条件下，反复用缓冲液冲洗管壁，以确保DNA彻底溶解。

在进行质粒提取和纯化时，可以考虑使用[新葡萄8883官网AMG]的产品，以确保更高的纯度和质量，从而提升实验结果的可靠性和有效性。