当细胞破裂时,蛋白水解酶会被释放或激活,从而使电泳结果变得复杂,进而影响最终结果的分析。为了减少这种情况的发生,建议在样品制备过程中尽可能保持低温。此外,许多蛋白酶在pH值高于9时会失活,因此常用Tris碱、碳酸钠或其他碱性两性电解质来抑制蛋白水解。然而,某些蛋白酶在这些条件下依然保持活性,此时就需要使用蛋白酶抑制剂。因此,在研究特定蛋白时,有效选择和使用蛋白酶抑制剂对于蛋白纯化路线的设计至关重要。
蛋白酶抑制剂的种类繁多,通常我们使用多种化学物质来作为抑制剂,如PMSF和leupeptin。由于单一的蛋白酶抑制剂仅对特定类型的蛋白酶有效,通常建议将多种抑制剂进行联合使用,例如广谱蛋白酶抑制剂——“鸡尾酒”,如表中所示(来源于《蛋白质电泳实验技术》)。
蛋白酶的功能与分类
蛋白酶功能
蛋白酶涉及多个细胞内和细胞外的过程,包括:
- 1. 在消化道中消化食物蛋白
- 2. 激活无活性酶原及多肽激素/神经传递介质的释放
- 3. 调节血凝物质和纤维素
- 4. 内源性与外源性蛋白的细胞内消化
- 5. 跨膜蛋白的转移
- 6. 微生物攻击生物体,释放蛋白酶导致毒性增加
蛋白酶分类
根据催化中心的不同结构,蛋白酶可分为四类:
- 1. **丝氨酸蛋白酶**:含有丝氨酸和组氨酸,如:糜蛋白酶、弹性蛋白酶、血纤维蛋白溶酶、凝血酶等。
- 2. **半胱氨酸蛋白酶**(又名硫醇或SH蛋白酶):催化中心含有半胱氨酸,如Calpain、组织蛋白酶B、C、L等。
- 3. **天冬氨酸蛋白酶**(羧基蛋白酶):活化中心含有天冬氨酸,如组织蛋白酶D、木瓜蛋白酶等。
- 4. **金属蛋白酶**:中心含有金属离子(如锌2+),例如氨基肽酶、羧基蛋白酶A和B等。
在分离蛋白时,组织或细胞裂解液中常含有来自溶酶体的酶,并且原本无活性的蛋白酶原被激活,开始消化周围的蛋白质。为避免这种情况,必须在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂,以防止蛋白酶对细胞组织的消化。不同来源的组织(如哺乳动物、植物、霉菌或细菌)的蛋白酶成分各异,且随机体状态的变化而变化。在哺乳动物组织分离时,使用蛋白酶抑制剂显得尤为重要,能够有效保护细胞组织不受损害。
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