通过体外转录（IVT）获得的mRNA反应混合物包含所需的mRNA产物以及多种杂质，包括T7 RNA聚合酶、无机焦磷酸酶、NTP、模板DNA、盐离子、添加剂和IVT过程中形成的mRNA副产物（如dsRNA和截断RNA片段）。这些杂质可能会对mRNA的功能产生负面影响，从而影响其量化的准确性、翻译效率或免疫原性。因此，必须采用纯化技术从IVT混合物中分离出目标mRNA，以确保其纯度和完整性，进而保证产品的安全性和有效性。常见的mRNA纯化方法包括：氯化锂（LiCl）沉淀、硫酸铵沉淀、磁珠纯化、硅胶柱膜纯化和层析纯化等。

氯化锂沉淀法是传统mRNA纯化的方法，通过锂离子在特定pH环境下减少RNA分子之间的同电性相斥，促进RNA聚集形成沉淀。然而，该方法在工业规模生产时，由于可能留下的锂盐具毒性，以及在低温下沉淀要求的高能源成本，限制了其应用。硫酸铵沉淀法则在一项研究中成功实现了对增强型绿色荧光蛋白（EGFP）编码的mRNA的有效分离，在18M硫酸铵浓度下，mRNA的沉淀率超过了95%。该研究建议的最佳条件为2M硫酸铵（AS），pH 7.0，温度20℃，沉淀时间2小时，可实现近100%的沉淀率和溶出率。

硅胶柱膜纯化基于硅胶膜表面的硅醇基团与mRNA分子之间的相互作用，在实施过程中，通过高盐环境促进RNA的结合，并有效释放非目标杂质，如蛋白质和脂类。此法安全无毒，符合环保标准，适合实验室使用。相对而言，磁珠法利用功能化的氧化铁磁珠与mRNA结合，通过磁场的作用实现纯化。其应用中的注意事项包括避免冷冻和过度干燥，以维护磁珠的活性。

当前，工业级别的mRNA纯化多数采用层析法，如Oligo(dT)亲和色谱。该方法通过与带有Poly(A)尾的mRNA特异性结合来高效捕获mRNA，同时结合不同疏水性原理或阴离子交换技术提高纯化质量。使用蛋白酶K等酶进行纯化，也能有效去除与核酸结合的蛋白质杂质，从而提高mRNA疫苗的安全性和有效性。

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