## 3T3-L1脂肪细胞诱导分化实验方案

3T3-L1细胞系来源于小鼠胚胎成纤维细胞，具有从快速分裂的前脂肪细胞向脂肪样细胞分化的能力。自1974年由Green和Kehinde首次分离以来，这一细胞系已广泛应用于脂肪细胞分化、代谢研究，以及探讨脂肪相关代谢性疾病如肥胖和糖尿病的机制。

### 诱导分化效果的检测

检测诱导效果的方法多种多样，其中油红O染色是经典的检测脂肪细胞内脂滴累积的技术。油红O是一种脂溶性染料，能够特异性结合细胞内中性脂质，形成显著的红色脂滴。通过显微镜观察脂滴数量和大小的变化，可以直观判断分化是否成功。

此外，还可以通过检测脂肪细胞特异性基因或蛋白的表达，如PPARγ（过氧化物酶体增殖物激活受体γ）、aP2（脂肪细胞脂肪酸结合蛋白）、LPL（脂蛋白脂肪酶）等，来评估细胞的分化程度，并通过Western Blot法分析相关蛋白表达水平。诱导分化后细胞形态的显著变化和脂滴的增加也可以作为初步判断成功与否的依据。

### 实验步骤

以六孔板为例，以下是3T3-L1细胞分化成脂肪样细胞的具体实验方案：

#### 第1阶段：细胞培养

1. 将细胞以每平方厘米3×10³个细胞的密度接种于六孔板中。
注意：（1）建议使用早代次的细胞，以确保良好的分化效果；（2）确保细胞铺板均匀，以避免分化不均匀和细胞漂浮。

2. 在DMEM高糖培养基中培养细胞，直至达到70%的汇合度，并且每2-3天更换一次培养基。
注：在DMEM中添加10%小牛血清或胎牛血清以促进细胞生长。当细胞生长到约90%的汇合度时，即可进行分化诱导。注意，分化前汇合度不应超过70%，以减少细胞死亡率。

#### 第2阶段：分化诱导培养基的配制

培养基的制备必须在无菌条件下进行。MDI诱导培养基（甲基异丁基黄嘌呤IBMX、地塞米松、胰岛素）和胰岛素培养基应新鲜制备。
**实验步骤**：

1. 制备储备溶液。在DMSO中制备IBMX（50 mM）和地塞米松（1 mM）的储备溶液。如果使用冻干胰岛素，请根据说明书进行复溶。

2. 配置100 mL MDI诱导分化培养基：

- DMEM: 100 mL
- IBMX（50 mM）: 1 mL
- 地塞米松（1 mM）: 100 µL
- 胰岛素: 最终浓度10 µg/mL。

3. 配置胰岛素培养基。在DMEM中加入胰岛素至最终浓度为10 µg/mL。

#### 第3阶段：3T3-L1细胞的分化

1. 从培养箱中取出细胞培养板，去除DMEM培养基，并每孔添加2-3 mL MDI诱导培养基（记为第0天）。
注意：（1）添加诱导剂时要轻推枪头以减少对细胞的冲击，防止细胞卷边；（2）诱导培养基需提前37℃预热。

2. 第3天，去除MDI诱导培养基，替换为2-3 mL胰岛素培养基。

3. 第6天，去除胰岛素培养基并添加新鲜的DMEM。

4. 通常在第7至10天可以观察到完全分化的脂肪样细胞。

5. 进行分化效果的检测，采用油红O染色技术可监测脂质积累，通过脂肪细胞标志物（如脂联素和FABP4）的表达追踪细胞分化。

注意：操作过程中，油红O染色液的稀释需要依据说明书进行，以确保最佳效果。

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