体外转录（IVT）法获得的mRNA生成的反应混合物中，除了所需的mRNA产物外，还包含了多种杂质，包括蛋白（如T7 RNA聚合酶和无机焦磷酸酶）、NTP、模板DNA、盐离子、添加剂以及IVT过程中产生的副产物（如双链RNA和截断RNA片段）。这些杂质可能对mRNA的功能产生负面影响，例如影响mRNA的定量分析、降低翻译效率或改变其免疫原性。因此，通过纯化技术将目标mRNA从混合物中分离出来，以确保其纯度和完整性，实现产品的安全性与有效性是至关重要的。

常见的mRNA纯化方法包括氯化锂（LiCl）沉淀、硫酸铵沉淀、磁珠纯化、硅胶柱膜纯化以及层析纯化等。其中，沉淀法、磁珠法和硅胶柱膜法操作简便，但由于纯化效率受限，多应用于科研与早期研发阶段；而在工业应用中，层析纯化是主要选择。

2024年1月，中科院过程工程研究所的张松平团队在其论文《Rapid and high recovery isolation of mRNA from in vitro transcription system by ammonium sulphate precipitation at room temperature》中探索了硫酸铵沉淀法的可行性。该研究以编码增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的mRNA为对象，发现当硫酸铵浓度达到18M时，mRNA的沉淀率超过95%，而在更高浓度下沉淀速率无显著变化。溶解率也是一个关键指标，它关系到mRNA的最终回收率。研究结果显示，在室温下，当硫酸铵浓度高于18M时，沉淀物在不含RNase的水中可迅速溶解，溶解率超过90%。最佳的沉淀条件被推荐为2M硫酸铵，pH 7.0，温度20℃，沉淀时间2小时，可实现接近100%的沉淀率和溶出率。

在对比硫酸铵和LiCl沉淀法的去除效果方面，两者在去除NTP的效率均高于99%，而DNA模板的去除率分别约为82%和86%。虽然后者的去除效率稍逊色于LiCl，但硫酸铵沉淀法具有在室温下操作的优势，使其在放大生产中更具可行性。

硅胶柱膜纯化主要依赖硅胶膜表面硅醇基团与mRNA之间的相互作用。在高盐环境下，阳离子桥的形成使mRNA能够有效结合在硅胶膜上，而在低盐或水溶液中，mRNA则被释放出来。硅胶膜对蛋白质、多糖及脂质等杂质的低吸附性，使其在高速离心时能够有效分离mRNA与杂质，因而被广泛应用于实验室与早期研发阶段。

磁珠法和层析法在工业级别的纯化中逐渐显现出其重要性。适用于mRNA的Oligo(dT)亲和色谱是主流方法，但由于其无法区分带有Poly(A)尾的ssRNA与dsRNA杂质，因此通常会联用疏水层析、阴离子层析等精纯手段。通过“高盐结合，低盐洗脱”的步骤，OligodT亲和层析法能够有效捕获mRNA分子，而缺乏Poly(A)尾的杂质则无法结合，最终通过降低盐浓度洗脱mRNA，收率可达90%以上。

在工业中，mRNA纯化的基本流程包括TFF1（过滤去杂质）、层析（捕获mRNA和去除dsRNA）和TFF2（最终制剂缓冲液的置换）。在IVT产物质量较高的情况下，蛋白酶K与TFF的结合工艺被采用来进一步纯化。蛋白酶K作为一种高效的广谱丝氨酸蛋白酶，能够有效去除与核酸结合的杂质。在这方面，强烈建议使用300KD孔径的TFF工艺，以确保高效去除蛋白酶K及NTP等杂质。

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