新葡萄8883官网AMG提供的RFL-6大鼠成纤维细胞培养说明书主要包括以下几个部分：细胞培养条件、细胞处理及培养步骤、注意事项，以及售后条款。

一、细胞培养条件

细胞名称：RFL-6大鼠成纤维细胞

生长特性：贴壁生长

冻存条件：无血清冻存液（货号：C7001）

培养体系：DMEM+10% FBS+1% 双抗

传代方法：第一次建议1:2传代，传代情况每2天更换培养基。

备注：采用无菌离心管收集培养基，以便于过渡对比培养。如对比效果欠佳，建议选购新葡萄8883官网AMG的完全培养基。

二、细胞处理

在收到细胞后，待培养至良好状态后，灌满完全培养液并封好瓶口，这是运输细胞的最佳方法。收到细胞后，使用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，然后将细胞瓶放置于超净台内，进行严格无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5% CO2培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态后再进行后续处理。显微镜下观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照保存，前三天的照片是重要的售后依据。如未提供照片，将默认收到状态良好。

三、培养步骤

a. 细胞传代

1. 若未超过80%汇合度，将瓶装的完全培养液收集至离心管中，保留5ml完全培养基，放入37℃、5% CO2孵箱培养。

2. 如果细胞密度超过80%，则进行传代，具体步骤如下：

（1）弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

（2）添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速取回操作台，轻敲培养瓶后加入5ml以上完全培养基以终止消化。

（3）轻轻吹打细胞，使其完全脱落后吸出，将悬液转移至15ml离心管中，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基重悬。

（4）将细胞悬液按1:2的比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2培养箱中培养。

b. 细胞冻存

1. 当细胞生长至培养瓶80%覆盖度时，弃去T25培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次。

2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后，加入5ml完全培养液终止消化，再轻轻吹打细胞使其脱落，将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。

3. 弃去上清，沉淀细胞加入1ml的无血清冻存液（货号：C7001），混匀后加入冻存管中。

4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱中。如需转入液氮罐，需在-80℃冰箱中存放24小时以上后再转入液氮罐。

c. 细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护面具），快速置于37℃水浴中解冻，直到冻存管中无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁。

2. 将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。

3. 弃去上清，沉淀后用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，放入37℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养。

4. 第2天更换新鲜完全培养基，继续培养。

四、注意事项

部分细胞可能因贴壁不牢固而在运输过程中脱落，属于正常现象。若脱落较多，可将培养瓶中的液体收集至离心管，1000rpm离心5分钟，收集上清进行过渡培养。之后加入胰蛋白酶1-2ml，轻轻吹打重悬，消化1-2分钟后加5ml完全培养基终止反应，再离心、弃上清，补加1-2ml培养基重悬，然后按1:2比例分瓶传代（两个T25瓶），补充新完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2培养箱中培养。

五、售后条款

1）细胞出现问题时的重发条件和标准：
   1. 运输途中遭遇的问题，如细胞丢失、瓶身破损，以及培养液严重漏液，均可重发；
   2. 若细胞污染，请在收到产品48小时内提供真实的实验结果，核实后重发；
   3. 常温发货的细胞静置24小时后或干冰冻存发货的细胞复苏24小时后，如绝大多数细胞未存活，需提供真实清晰的细胞状态照片，重发；
   4. 如干冰冻存发货的细胞复苏24小时后或常温发货的细胞静置4小时后若未开封出现污染，重发；
   5. 细胞活性问题，请在收到产品7天内提供真实的实验结果，并用台盼蓝染色法鉴定细胞活力，核实后可重发；
   6. 在收到细胞当天以及第2、3天内请拍照，3天未告知将视为产品合格。若4-7天内出现问题并提供收到细胞前3天及出现问题时的照片和操作步骤，并且与技术人员沟通的，经技术人员判定为我方责任的，则重发。若判定为双方责任，则由双方协商处理，或按合同价50%收取重发费用。

2）细胞问题不予重发的情况包括：
   1. 客户造成的细胞污染，不重发；
   2. 客户因不正确操作致使细胞状态不佳，不重发；
   3. 采用非本库推荐的细胞培养体系导致细胞状态不佳，不重发；
   4. 若细胞状态不佳，并未提供培养前3天的照片，不重发；
   5. 在细胞培养过程中经过其他处理的，不重发；
   6. 收到细胞2天内未告知的，不重发；
   7. 具体情况视而定。

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